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Portaobjetos mojados provisionales
Un portaobjeto mojado es un espécimen de una platina en una gota de fluido (agua, solución salina o solución colorante) preparado para el examen bajo alta y baja tensión. Debido a que el fluido se evaporará, el portaobjeto es provisional. Limpie ambos lados de un portaobjeto de vidrio y de un cubreobjeto. Coloque una gota de agua en el centro del portaobjeto. Coloque un pequeño articulo (un pedazo de piel de cebolla, elodea, hoja, pelo, o gota de agua de estanque) en la gota de agua. Añada más agua para cubrir el artículo, si es necesario. Luego coloque el cubreobjeto sobre la gota. El mejor método para colocar el cubreobjeto es sostenerlo en un ángulo de aproximadamente 45 en relación al portaobjeto y hacerlo descender cuidadosamente con un alfiler hasta que cubra el agua. Se pueden eliminar las burbujas en el cubreobjeto con el extremo romo de un lápiz. Es posible eliminar el exceso de agua del portaobjeto tocando un extremo del cubreobjeto con papel filtro o papel secante. El papel absorbe el agua. Ud. ya ha preparado un portaobjeto mojado o un portaobjeto de agua. Este durará por algunas horas.
Para prevenir la hinchazón
Es posible que las células que tienen una concentración de sal relativamente alta se hinchen cuando se les monta en agua corriente o de acuario. Esta hinchazón puede prevenirse colocando las células en una solución de sal (cloruro de sodio) al 0.7 por ciento; luego coloque el cubreobjeto. La solución de sal no deberá ser tan fuerte o concentrada como para que las células pierdan agua y se reduzcan.
Para retardar la evaporación
Para que las platinas duren más tiempo, se puede aplicar vaselina, petrolato o cera de vela alrededor del cubreobjeto para retardar la evaporación: Un método para hacer esto es sumergir la boca de un tubo de ensayo en la vaselina o petrolato. Aplique este círculo de vaselina alrededor de la gota de material en el portaobjeto y coloque un cubreobjeto de tal manera que sus bordes queden sellados al costado.
Cortando secciones a mano
La mayoría de los tejidos no son lo suficientemente rígidos (inclusive cuando han sido fijados) como para ser cortados en secciones delgadas sin antes colocarlos en parafina. Sin embargo, algunas hojas de plantas y tallos leñosos pueden ser insertados entre pedazos de zanahoria fresca y luego cortados con un micrótomo o a mano con una hoja de afeitar.
Corte un pedazo de zanahoria por la mitad. Coloque el articulo que se debe cortar entre las dos mitades. Envuelva este bulto, uniéndolo firmemente, y remójelo durante algunas horas. La médula y el tejido adjunto se dilatarán y volverán rígidos. Entonces puede cortarse el material en secciones delgadas con una hoja de afeitar. La hoja deberá sostenerse en un ángulo pequeño en relación a la superficie del espécimen. Mantenga mojados el espécimen y la hoja de afeitar. Haga flotar las secciones en agua para que no se enrosquen. Haga flotar solamente las secciones buenas y unifórmente finas sobre un portaobjeto y cubra con un cubreobjeto. La coloración (teñido) es opcional.
Preparación de gota suspendida
Si se examinara una gota de agua bajo el microscopio, la luz seria reflejada en muchas direcciones. Para evitar esto, se aplana la gota con un cubreobjeto. Sin embargo, al hacer esto se reduce la movilidad del organismo o, inclusive, se les aplasta con el peso del cubreobjeto. Una preparación de gota suspendida permite que los estudiantes estudien la movilidad de bacterias, la fisión en los protozoos, la germinación de granos de polen y fenómenos similares. Use un portaobjeto y un cubreobjeto limpios para que la tensión superficial del agua no sea reducida. Corte una "arandela", un círculo cartulina gruesa con un agujero grande en él. El tamaño del agujero deberá ser ligeramente más pequeño que el tamaño del cubreobjeto. Aplique un poco de vaselina a los dos lados de la arandela de cartulina. Presiónela sobre el portaobjeto. Coloque una gota de medio de cultivo sobre el cubreobjeto. Coloque el portaobjeto invertido sobre el cubreobjeto de manera que el borde del cubreobjeto y el de la arandela sean sellados con la vaselina. Invierta rápidamente toda la preparación. La gota de medio deberá estar ahora suspendida del cubreobjeto.
Si no se necesita una gota suspendida, pero Ud. no desea aplastar un articulo tan pequeño, puede levantarse el cubreobjeto con bastante facilidad. Se pueden colocar pedazos de cubreobjetos rotos (o para artículos más grandes, pedazos de vidrio roto) sobre el portaobjeto, alrededor del articulo, para que el cubreobjeto repose sobre el vidrio. Deberá añadirse suficiente agua o medio como para llenar el espacio entre el portaobjeto de vidrio y el cubreobjeto.
Concentración de los organismos en un cultivo
Muchos estudiantes querrán examinar protozoos, flagelos y otros organismos móviles. Algunas veces, el cultivo puede estar demasiado diluido, es decir, solo hay unos cuantos organismos en el cultivo, lo que da como resultado un número reducido de especímenes incluidos en una gota de fluido para un portaobjeto provisional. Los estudiantes pueden aumentar el número de organismos vertiendo el cultivo en un frasco largo o en un tubo de ensayo, y cubriendo todo, excepto el cuarto superior del tubo, con papel carbón, o preparando un pedazo corto de tubería de vidrio. Insértelo en un tapón de un solo agujero en un frasco lleno de cultivo, y cubra el frasco con papel carbón. Los protozoos se concentran en las partes descubiertas (la parte superior del tubo de ensayo o la tubería en los tapones porque la mayoría de los protozoos poseen un fototropismo positivo o un geotropismo negativo, o se reúnen donde la concentración de oxigeno es mayor en la superficie). Usando un gotero medicinal, es posible colocar un gran numero de organismos en un portaobjeto en una gota de medio.
Disminuyendo la velocidad de los protozoos
Los protozoos, especialmente las formas ciliadas, se mueven con demasiada rapidez como para que los estudiantes de secundaria, en especial los principiantes, puedan observarlos bajo el microscopio. Existen varias maneras de disminuir la velocidad de los ciliados para poder estudiarlos de cerca y con detenimiento.
Una manera es simplemente preparar portaobjetos con anticipación y dejar que el fluido se evapore. A medida que la evaporación continúa, el peso del cubreobjeto es suficiente para disminuir la velocidad de estos organismos.
Se puede colocar un anillo de celulosa de metileno o solución de gelatina en el portaobjeto y añadir una gota de medio de cultivo en el anillo. Se coloca el cubreobjeto sobre la mezcla. A medida que la celulosa de metileno se esparce hacia el centro de la gota, los protozoos disminuirán su velocidad.
Flujo citoplasmático (ciclosis)
El flujo citoplasmático alrededor de una celarla puede ser observado en muchas celarlas vivas montadas en una solución salina o en agua de acuario. Con frecuencia, los cloroplastos en las células de plantas verdes se mueven alrededor del borde de una celarla. Muchas plantas acuáticas evidencien esta circulación de citoplasma llamada ciclosis. Monte una hoja de elodea (Anacharis), Nitella, Chara, o Vollismeria sobre un portaobjeto limpio. En la elodea, use las puntas en crecimiento y concéntrese en las células de la nervadura central. En la Nitella y Chara, concéntrese especialmente en las células entre los nudos. Mantenga la capa de células más elevada mirando hacia arriba en el portaobjeto. Coloque las hojas en agua caliente o acerque una luz para calentamiento al recipiente para estimular la ciclosis. La velocidad de flujo puede ser de 3 a 15 cm. por hora y alcanzar hasta 45 cm. por hora a una temperatura aproximada a los 30° C.
En la Nitella hay muchos núcleos en las células entre los nudos, y éstos también se mueven. Sin embargo, los cloroplastos se encuentran fijos dentro de la superficie interior de las paredes celulares y, en consecuencia, no se mueven.
El flujo citoplasmático puede también observarse en otras substancias vivas. Monte en agua o glicerina hilos de micelio del hongo del pan Mucor. Es posible observar citoplasma fluyendo hacia arriba uno de los lados del hilo y hacia abajo por el otro.
Pelos unicelulares en las raíces de plantas pequeñas de Tradescantia o los pelos estaminados en la flor también muestran muy bien la ciclosis. Monte el filamento del estambre, el cual tiene muchos pelos unidos a él, en agua sobre un portaobjeto. Es posible observar gránulos moviéndose de los filamentos alrededor del núcleo a lo largo de la pared hacia otro filamento que va hacia el núcleo.
La epidermis obtenido de una de las escamas interiores de una cebolla también demostrará la ciclosis si se le monta en agua sin solución colorante.
En amebas también se puede estudiar el flujo con facilidad. Monte una gota de la solución de cultivo en un portaobjeto limpio. Añada pedazos de cubreobjeto de vidrio rotos para sostener el cubreobjeto. Esto se hace para que los espécimenes no sean aplastados. Se podrán observar muchas vacuolas y el citoplasma fluyendo activamente que cambie de sol a gel.
Técnicas simples para tenir portaobjetos provisionales
Substancias químicas para técnicas
microscópicas
Técnica para preservar partes de plantas en
tela plástica
Para preparar esqueletos de plantas
Recolección y preservación de animales
Soluciones
y medios nutritivos
Soluciones
biológicas
Modelos
Soluciones colorantes no vitales
El yodo de Lugol, el violeta cristal y la solución colorante de Gram tiñen ciertas estructuras de la célula. Durante este proceso de coloración o teñido, algunas proteínas son desnaturalizadas y la célula muere inmediatamente. Las células vivas no pueden ser estudiadas con estas soluciones colorantes no vitales.
Soluciones colorantes vitales
En muchas ocasiones puede necesitarse que células vivas resalten detalles específicos de la estructura celular. Las soluciones colorantes vitales matan los organismos lentamente. Los organismos absorben estas soluciones colorantes y continúan con sus funciones vitales por algún tiempo. En consecuencia, es posible teñir la célula viva para mostrar cilios, flagelos o estructuras intercelulares. Estas soluciones colorantes vitales son el azul de metileno, el rojo neutral y el rojo conga. Los métodos para la preparación de estas soluciones colorantes vitales se mencionan en la sección "Técnicas microscópicas Soluciones Colorantes".
Los métodos para soluciones colorantes vitales y no vitales son los mismos. Las técnicas de coloración o teñido que se mencionan aquí son utilizadas para portaobjetos provisionales. La mayoría de los materiales pueden ser teñidos efectivamente por estos métodos. Los materiales utilizados por lo común son células de la planta y piel de cebolla, celarlas de la epidermis de la mejilla humana, tejido animal, platinas de sangre y cultivos de protozoos y algas.
Técnicas para teñir
Coloque una gota de solución colorante en un portaobjeto limpio y déjela secar como una película uniforme sobre el portaobjeto. Puede preparar varios portaobjetos de estas películas secas de solución colorante y mantenerlos almacenados en una caja limpia. Cuando se les vaya a usar, solamente añada una gota de cultivo de protozoos, bacteria, cultivo de levadura, o células de tejido en un portaobjeto. La solución colorante se disolverá lentamente en la gota de material en el portaobjeto. Cuando se prepare un portaobjeto mojado, añada una gota de solución colorante sobre el espécimen o gota de medio de cultivo en el portaobjeto. Luego coloque el cubreobjeto. Sostenga el cubreobjeto a un ángulo de aproximadamente 45° en relación al portaobjeto y hágalo descender lenta y suavemente con alfiler hasta que cubra el agua. Es posible eliminar las burbujas golpeando levemente el cubreobjeto con el extremo romo de un lápiz. Otro método para preparar un portaobjeto mojado provisional (los cultivos de protozoos y algas no pueden ser teñidos utilizando este método) es colocando una gota de solución colorante en uno de los extremos de un cubreobjeto y luego conducir la solución colorante bajo el cubreobjeto absorbiendo el agua con un pedazo de papel filtro desde el lado opuesto del cobreobjeto. La solución colorante se esparcirá en el material.
Una solución colorante de yodo teñirá el núcleo de marrón y el citoplasma de un marrón muy claro. Los azules de metileno teñirán el núcleo de azul y el citoplasma de azul claro. Si la solución colorante no es lo suficientemente oscura, se puede añadir otra gota de solución colorante de la misma manera. Se puede aclarar el color añadiendo agua en lugar de solución colorante para diluir la solución colorante.
Manchas hechas con la punta de la raíz de una cebolla
Este es un método fácil para la preparación de portaobjetos útiles para explicar la mitosis. La células en división en las que los cromosomas se encuentran presentes pueden encontrarse con facilidad en un portaobjeto preparado de la siguiente manera.
Coloque un bulbo de cebolla en agua por uno o dos días hasta que comiencen a aparecer pequeñas raíces blancas en el bulbo. Con una hoja de afeitar, corte el último centímetro de la punta de la raíz. Deje caer la raíz en un vaso de laboratorio que contenga 1N HCl por solamente tres minutos. Luego retire la punta de la raíz y colóquela en un portaobjeto con varias gotas de solución colorante de acetocarmín por varios minutos. No permita que la punta de la raíz se seque. Con mucho cuidado corte y desprenda la porción de la raíz que presente una coloración intensa. Descarte el resto del material. Con una hoja de afeitar, corte esta porción restante en pedazos del tamaño de la cabeza de un alfiler. Rápidamente coloque el cubreobjeto sobre el material. Cubra el portaobjeto y cubreobjeto con un pedazo de papel. Presione el cubreobjeto cuidadosa e uniformemente para aplastar las células; no tuerza el cubreobjeto. Retire el papel y examine las células. Si sella el extremo del portaobjeto con cera de vela, el portaobjeto puede durar 15 días
Manchas de sangre
Las manchas de sangre son una técnica para preparar portaobjetos permanentes o semipermanentes. Deberá usarse sangre fresca de un dedo o de un animal. Si se obtiene sangre del carnicero, deberá añadirse 0,1 gramos de oxalato de potasio o sodio por cada 100 ml. de sangre. Esto prevendrá que la sangre se coagule. Coloque una gota de sangre directamente sobre un extremo de un portaobjeto muy limpio. Artículos de vidrio lavados químicamente son un requisito en la preparación de manchas de sangre. Los portaobjetos pueden limpiarse en alcohol de 95% y flamearse sobre una lámpara de alcohol. Coloque un segundo portaobjeto con un extremo en un ángulo de 30° en relación al primer portaobjeto. Lleve el portaobjeto superior hasta la gota de sangre hasta que la gota de sangre se esparza de manera uniforme a lo largo del extremo angosto del portaobjeto. Empuje el portaobjeto superior hacia el extremo opuesto del primer portaobjeto para formar una película delgada. Mientras mayor sea el ángulo entre los dos portaobjetos, más gruesa será la película. Deje secar el portaobjeto al aire libre.
Técnica de Wright para teñir sangre
La técnica de Wright para teñir sangre es un método rápido y fácil para preparar una mancha de sangre que le permitirá distinguir los diferentes tipos de células blancas. Utilice un portaobjeto con una mancha de sangre en él. Coloque el portaobjeto sobre un plato. Esto evitará que el exceso de solución colorante toque o quede en la superficie inferior del portaobjeto. Cubra la película de sangre seca completamente con solución colorante de Wright de 1 a 3 minutos. Esto fija las células sanguíneas al portaobjeto. Luego añada agua destilada al portaobjeto, gota a gota, hasta que la solución colorante se diluya a la mitad y espuma de color verde metálico aparezca en la superficie del portaobjeto. Deje que esta solución permanezca en el portaobjeto de 2 a 3 minutos. Luego lávelo con agua destilada; lave dos o tres veces. Ahora examine el portaobjeto bajo el microscopio; los gránulos en los basófilos deberán teñirse de azul intenso, las células eosinófilas de rojo brillante, y los neutrófilos de lila. Si el portaobjeto es demasiado oscuro, éste puede decolorarse lavando con más agua destilada.
Solución colorante de Giemsa
La solución colorante de Giemsa se usa tanto para manchas de sangre como para manchas de bacterias.
Una parte de la solución base concentrada se deberá diluir en diez partes de agua destilada.
Utilice una mancha de sangre secada al aire y fije la película al portaobjeto colocándola en alcohol metílico de 70% de tres a cinco minutos. Seque el portaobjeto al aire. Luego coloque el portaobjeto en un plato o frasco (en el frasco de Coplin, si se cuenta con uno) que contenga solución colorante de Giemsa de 15 a 30 minutos. Finalmente lave el portaobjeto en agua destilada y séquelo.
Manchas de bacterias
Para preparar manchas de bacterias, las bacterias deberán encontrarse en una suspensión liquida. Si las bacterias provienen de agur sólido o de un cultivo de papa, se deberá transferir una pequeña colonia a 5 ml. de agua esterilizada y mezclarse. Se coloca un pequeño lazo de alambre lleno de la suspensión sobre un portaobjeto limpio. Se deberá esparcir la gota para obtener una película fina y dejar a ésta secar al aire. Cuando la película se haya secado, pase la superficie inferior del portaobjeto a través de la llama de un mechero de bunsen tres voces, o seis veces a través de la llama de una lámpara de alcohol. El fondo del portaobjeto deberá sentirse tibio y no demasiado caliente al tacto. Las bacterias ya han sido fijadas al portaobjeto y no se desprenderán durante el proceso de teñido.
Muchas soluciones colorantes (generalmente aquellas que son tintes básicos de anilina, como la fucsina básica, el violeta cristal, el azul de metileno y la safranina) puede ser usadas para colorear la bacteria. Se deberá diluir la solución colorante; vierta una parte de la solución base concentrada en diez partes de agua. Se deberá aplicar la solución colorante de uno a dos minutos, lavando luego y, por último, secando con papel secante. Los cubreobjetos no son necesarios a menos que quiera volver sus portaobjetos en permanentes. En tal caso, añada una gota de bálsamo cuando el portaobjeto esté seco y luego añada un cubreobjeto.
Método de Gram para teñir manchas de bacterias
El método de Gram para teñir manchas de bacterias es importante para clasificar y distiguir bacterias. Los organismos grampositivos se tiñen de violeta o azul. Generalmente, éstas son bacterias cocáceas (redondas), excepto los grupos de meningococos, gonococos y catarrales. Las bacterias gramnegativas toman un tinte rosado o rojizo. Los espirilos, espiroquetas, la mayoría de los bacilos (bastoncitos) que son bacterias a prueba de ácidos, y muchas formas que producen esporas son gramnegativos.
El procedimiento involucra teñir, desteñir o decolorar, y luego volver a teñir. Los organismos grampositivos no se decoloran y mantienen el color violeta; los organismos gramnegativos pierden todo el color del primer teñido y recogen solamente el rojo del segundo teñido.
Tome una mancha de bacterias que haya sido fijada pasándola varias veces a través de la llama de un quemador y cubra el portaobjeto con solución colorante violeta cristal por un minuto. Vierta la solución colorante y añada solución colorante de Gram por un minuto. Quite esta solución lavando con agua y decolore con alcohol etílico de 95%. Lave varias veces con alcohol etílico de 95% hasta que no se desprenda más solución colorante. Vuelva a lavar el portaobjeto en agua y vuelva a teñir cubriendo totalmente el portaobjeto con tinte de safranina por medio minuto. Lave con agua, seque y examine bajo el microscopio.
Técnicas microscópicas para portaobjetos permanentes
El procedimiento general para teñir y montar portaobjetos permanentes es el siguiente:
1. Fije el tejido y endurezca.
2. Deshidrate por medio de una serie de alcoholes.
3. Limpie el tejido en xilol.
4. Encaje en parafina.
5. Corte en secciones con un micrótomo.
6. Fije secciones en un portaobjeto.
7. Disuelva parafina con xilol.
8. Pase por una serie de alcoholes hasta llegar al agua destilada.
9. Tiña, vuelva a teñir, destiña, si es necesario.
10. Deshidrate por medio de una serie de alcoholes hasta llegar al xilol.
11. Monte en bálsamo.
12. Estudie bajo el microscopio.
Fijación
Los tejidos deben ser colocados en fijadores por dos razones. Primero, porque las células deben ser matadas rápida y uniformemente para que el contenido de las mismas se conserve y se parezca mucho al de la célula viva. La segunda razón es que el fijador endurece el tejido de manera que pueda ser cortado en secciones delgadas y transparentes.
Algunos fijadores deben ser eliminados por medio del lavado antes de que las células puedan ser teñidas. Normalmente, las células se colocan en el fijador por suficiente tiempo para asegurar que todas las células hayan sido matadas (48 horas para especímenes grandes). Luego se elimina el fijador por medio del lavado, y el tejido se coloca en un preservativo hasta que se le vaya a teñir. Los fijadores que contienen cloruro mercúrico o ácido pícrico deben ser lavados por lo menos durante una hora en alcohol de 70%. Si el tejido contiene dicromato de potasio, el tejido deberá ser lavado en agua corriente por lo menos durante una hora. Más adelante se puede encontrar una sección con una lista de fijadores y preservativos.
Deshidratación
Una vez que el tejido ha sido fijado y los fijadores han sido eliminados, el siguiente paso es eliminar el agua del tejido. Esto deberá hacerse de manera gradual de manera que la diferencia entre la velocidad de difusión del alcohol y la del agua no deformen los delicados tejidos y que la parafina entre a todos los espacios normalmente ocupados por el agua. Esto brinda soporte al tejido cuando éste está siendo cortado en secciones finas.
Normalmente se transfieren los tejidos del preservativo a alcohol etílico de 70%. Sin embargo, los tejidos muy delicados primero se lavan en agua y luego, gradualmente, se les lleva hasta alcohol de 70%, pasando por alcohol de 30% y 50%. Mantenga los tejidos por una hora en cada solución de alcohol. Una vez que el tejido haya permanecido en alcohol de 70% por unas cuantas horas, transfiéralo a alcohol de 95% por una hora, luego a alcohol puro (100%) por no más de una hora.
Del alcohol puro transfiera el tejido a xilol, un agente limpiador, (también llamado xileno) para preparlo para la fijación en cera. Se utiliza el xilol para eliminar el alcohol de los tejidos y permitir que la parafina penetre los espacios en el tejido. Mantenga el tejido en xilol de dos a tres horas. Si el xilol se vuelve turbio, regrese el tejido a alcohol puro fresco; la turbiedad indica algunas voces que el tejido no ha sido deshidratado completamente.
Encajar o fijar
Cuando los tejidos han sido limpiados, éstos se encuentran listos para ser encajados o fijados en parafina derretida. cera deberá ser derretida con anticipación y mantenida en un horno de parafina, o en un baño de agua (se deberá colocar un cristal de reloj sobre los recipientes con parafina y una plancha de vidrio grande sobre el recipiente lleno de agua). La temperatura de la cera se deberá mantener a uno o dos grados sobre el punto de fusión.
Se deberá colocar el espécimen en un pequeño recipiente de papel y cubrírsele con parafina fresca (se puede fabricar un recipiente pequeño doblando papel y dándole la forma de un cubo de una pulgada). Después de una hora, se deberá retirar la cera y añadirse cera fresca. Después de otra hora, se deberá colocar cera fresca en el recipiente con el espécimen. Entonces se retira el recipiente de la parafina y se le deja enfriar. Se puede acelerar el proceso de enfriamiento colocando el recipiente en agua fría. Una vez que se haya formado una película sobre la cera, se puede sumergir el bloque. Cuando la cera se haya endurecido por completo, ésta puede ser retirada del recipiente de papel. Recorte el bloque de parafina a un tamaño pequeño para que quepa en el soporte del micrótomo, pero de manera que aún quede cera alrededor del espécimen. Sujete el bloque al soporte derritiendo uno de los extremos del bloque y presionándolo contra el soporte.
Seccionar
Una vez que el bloque y el soporte han sido unidos firmemente y montados en el micrótomo, se deberán acomodar la hoja y el bloque de manera que se pueda cortar una sección de 6 a 9 micras de ancho. (Una micra es igual a 1/25,000 de pulgada). A medida que se corta, se va formando una tira de secciones de cera; levante unas cuantas secciones con la ayuda de una aguja y una hoja, y hágalas flotar en agua ligeramente caliente que esté cubriendo un portaobjeto preparado. El portaobjeto deberá prepararse con una película delgada de albúmina. La temperatura del agua deberá encontrarse por debajo del punto de fusión de la parafina. Las secciones de cera se hincharán hasta alcanzar su tamaño máximo (no se deberán formar arrugas y, de ocurrir, descarte). Elimine el agua y coloque el portaobjeto en un horno de secado a 37°C por 24 horas. Si se acorta este periodo, las secciones se desprenderán durante el proceso de teñido.
Hidratación
Se deberá eliminar la cera de los portaobjetos para que los tejidos puedan ser teñidos. El portaobjeto se coloca en xilol por cinco minutos para disolver la cera. Luego se le transfiere a alcohol absoluto por tres minutos para eliminar el xilol.
Luego se pasa el portaobjeto por alcoholes de 95%, 70%, 50% y 30% por un periodo de dos minutos en cada solución. Luego se le coloca en agua destilada por un minuto. Ahora se encuentra listo para ser teñido porque la mayoría de las soluciones colorantes son acuosas.
Teñido y montaje
Normalmente el portaobjeto se saca del agua y se le coloca en una solución colorante nuclear (una solución colorante básica que tiñe cromosomas, centrosomas, nucléolos, corcho, epidermis cutinizada y xilema de plantas) por dos minutos. Luego se lava el portaobjeto en agua fresca hasta que el color se destiña. El proceso de deshidratación se sigue hasta llegar al alcohol de 90% (es el inverso del proceso de hidratación). En este nivel se coloca el portaobjeto en una solución colorante básica (citoplasmática) por un minuto. Esta tiñe el plasma, los cilios y las estructuras celulosas de las células. Luego se enjuaga el portaobjeto en alcohol de 95%, llevándosele después a xilol donde permancerá hasta que se le monte en bálsamo de Canadá.
Existen muchas soluciones colorantes ácidas y bases, y cada una tendrá un proceso recomendado para su uso. Algunos de éstos se indican en la sección sobre soluciones colorantes.
Tiñiendo secciones de Gimnosperma y Angiosperma
Materiales requeridos:
Pinceles pequeños (de los usados para acuarelas).
Aguja.
Cristales de reloj.
Una hoja de afeitar nueva de borde afilado.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Safranina, verde claro, violeta de genciana, naranja.
Aceite de clavero.
Bálsamo de Canadá.
Soluciones de alcohol al 30%, 50%, 70% y 100%.
Xilol.
Solución de caucho (usada para la reparación de bicicletas).
Procedimiento: Corte la parte que se requiere (tallo, raíz, hoja, peciolo, etc.) de material fresco o de material preservado en alcohol de 70%. Corte secciones delgadas y uniformes con la hoja de afeitar. La sección se deberá sumergir en agua en un cristal de reloj. Manteniendo la sección en el portaobjeto, examínela bajo un microscopio compuesto. Tenga cuidado de que todas las partes se encuentren presentes y limpias. Transfiera la sección del agua, con un pincel, a un pequeño montículo de safranina en otro cristal de reloj. Manténgala ahí de 3 a 4 minutos (si se le deja por más tiempo, la sección tomar" una coloración rojo oscuro). Retire la sección con un pincel y transfiérala a alcohol de 30% en otro cristal de reloj. Luego de 3 a 5 minutos, transfiérala a alcohol de 50%. Manténgala ahí de 3 a 5 minutos y transfiérala luego a alcohol de 70%. La sección se deberá mantener ahí por 5 minutos si es de color rojo oscuro, o por 3 minutos si el color es claro. Luego transfiérala a alcohol de 100% de 3 a 5 minutos. Lávela en aceite de clavero. Añada un poco de verde claro al aceite de clavero y manténgala ahí de 3 a 5 minutos. Nuevamente, transfiera la sección a otro cristal de reloj que contenga aceite de clavero. (Es posible mantener las secciones en aceite de clavero por períodos más extensos). Examine la sección bajo un microscopio compuesto. Tome la sección en el portaobjeto junto con una gota de aceite de clavero. Use una aguja de vidrio para colocar una gota de bálsamo de Canadá en el centro del portaobjeto y coloque la sección en la gota. Sostenga el cubreobjeto en un ángulo de 45° y, con la aguja, deje caer el cubreobjeto gradual y lentamente mientras que el bálsamo de Canadá se está esparciendo. Esto evita la entrada de burbujas en el bálsamo. Se deberá tener cuidado de que el bálsamo no se escape del cubreobjeto. Si se forman burbujas de aire, caliente el portaobjeto con cuidado sobre una lámpara de alcohol para eliminarlas. Elimine el exceso de bálsamo con xilol.
Mezcle xilol y solución de caucho de manera que se forme un líquido pejagoso. Una vez que el portaobjeto haya reposado por dos o tres días selle los extremos del cubreobjeto con la mezcla pejagosa de xilol-solución de caucho. Si el portaobjeto está completamente seco, el sello no es necesario. Si no ha secado, deberá ser sellado para prevenir que el aire penetre.
Cualquier sección puede ser teñida usando el método antes descrito. La combinación deberá ser safranina y verde claro o violeta de genciana y naranja. Por lo general, los vasos de xilema tomarán la safranina o solución colorante violeta, y las otras partes la solución colorante verde claro o naranja.