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Substancias químicas para técnicas microscópicas

Soluciones colorantes vitales

1. Azul de metileno: Se diluye una parte de solución base concentrada en 10.000 partes o más de agua destilada. Una gota de esta solución colorante diluida teñirá el núcleo así como las partículas citoplasmáticas.

2. Rojo neutral: El rojo neutral se diluye en alcohol puro, una parte por 3.000 a 30.000 partes de alcohol. Tiñe el núcleo ligeramente.

3. Rojo conga: Se utiliza como solución colorante cuando se diluye una parte en 1.000 partes de agua. En la presencia de ácidos débiles se torna de rojo en azul.

Soluciones colorantes simples

1. Solución colorante de yodo (Solución colorante de Lugol): Se prepara disolviendo 10 gramos de yoduro de potasio en 100 ml. de agua destilada y luego añadiendo 5 mg. de yodo. Tiñe los flagelos, cilios y núcleos de las células.

2. Violeta cristal: Se prepara añadiendo 13,87 gramos (o más) de tinte a 100 ml. de alcohol etílico de 95%. Deje reposar la mezcla por dos días, removiendo con frecuencia; filtre y almacene. Es una buena solución colorante para bacterias y protozoos.

3. Solución colorante de Gram: Esta es otra solución colorante de yodo y puede prepararse diluyendo una parte de solución colorante de Lugol en 14 partes de agua. El procedimiento para su uso se presenta bajo el titulo "Método de Gram para teñir manchas de bacterias".

4. Safranina: Es una solución colorante básica para material nuclear. Se prepara con 3,41 gramos de tinte añadidos a 100 ml. de alcohol etílico de 95%. Se le deja reposar por dos días removiendo con frecuencia. Filtre antes de almacenar.

5. Verde de metileno: Esta es una buena solución colorante nuclear para uso general. Se prepara disolviendo 1 gramo de tinte en 1 ml. de ácido acético puro. Luego se diluye con agua destilada para obtener 100 ml. de solución al 1%.

6. Eosina de etilo: Es un tinte ácido usado para contrarrestar soluciones colorantes nucleares. Prepare una solución al 0,5% con alcohol etílico.

7. Acetocarmín: Es un tinte fácil de usar que diferenciará muy bien el núcleo. Sature una solución en ebullición de ácido acético al 45% con polvo de carmín y luego filtre. Use una gota de solución colorante por cada gota de cultivo de protozoos.

8. Fucsina básica: Esta es una buena solución colorante para bacterias que se prepara añadiendo 8,16 gramos de tinte a 100 ml. de alcohol etílico de 95%. Deje reposar la mezcla por dos días, removiendo con frecuencia. Filtre antes de almacenar.

9. Azul de metileno: Como solución colorante para bacterias, se prepara añadiendo 1,48 gramos de tinte a 100 ml. de alcohol etílico de 95%. Se le deja reposar por dos días, removiendo con frecuencia, y filtrándola antes de almacenarla. No se necesita ninguna dilución. Si se usa como solución colorante vital, diluya una parte en 10.000 partes de agua destilada.

10. Hematoxilina de Delafield: Esta solución colorante puede ser comprada ya preparada o puede prepararse siguiendo el siguiente procedimiento:

1. Disuelva 4 gramos de hematoxilina en 25 ml. de alcohol puro.
2. Añada 400 ml. de una solución acuosa saturada de alumbre de amonio. Exponga la solución a la luz por dos días en una botella taponada con algodón. Filtre.
3. Añada 100 ml. de alcohol de metileno y 100 ml. de glicerina. Mezcle bien.
4. La solución colorante deberá madurar por dos meses a temperatura ambiente antes de estar lista para el uso.
5. Finalmente, almacénela en botellas adecuadamente tapadas. Lave los espécimenes en agua antes de ponerlos en esta solución colorante.

11. Naranja de metileno: Esta solución es muy usada como indicador, pero también constituye una buena contrasolución colorante. Se prepara una solución al 0,1% disolviendo 0,1 gramos de naranja de metileno en 130 ml. de agua destilada.

Soluciones colorantes para la sangre

1. Violeta de metileno: Esta solución colorante puede ser usada para teñir células de la sangre de anfibios o humanos. Para anfibios, mezcle 0,05 gramos de violeta de metileno y 0,02 ml. de ácido acético puro con 100 ml. de solución de cloruro de sodio al 0,7%. Para células de sangre humana, use una solución de cloruro de sodio al 0,9%.

2. Solución colorante de Wright para la sangre: Lo mejor es comprar esta solución colorante. El procedimiento para su uso puede encontrarse en la sección de técnicas microscópicas bajo manchas de sangre.

3. Solución colorante de Giemsa: El procedimiento para su uso puede encontrarse bajo manchas de sangre en la sección de técnicas microscópicas. Puede comprarse esta solución colorante, o puede mezclarse de la siguiente manera: disuelva 0,5 gramos de polvo de Giemsa en 33 ml. de glicerina (esto puede tomar de 1 a 2 horas). Luego añada 33 ml. de alcohol de metileno puro sin acetona. Una parte de esta solución base concentrada deberá ser diluida en diez partes de agua destilada para su uso en el laboratorio.

Fijadores

1. Solución de alcohol etílico al 70%: Este es un preservativo común para formas pequeñas y especímenes de tejidos. Se prepara añadiendo 25 ml. de agua a 70 ml. de alcohol de 95%.

2. Alcohol puro: Caliente cristales de sulfato cúprico hasta que sólo quede un polvo blanco. Añada esta forma anhidra a alcohol etílico de 95%. Haga esto hasta que el sulfato cúprico que se añade no se vuelva azul en el alcohol. Luego se elimina toda el agua. Filtre el alcohol rápidamente y almacene en botellas para almacenaje secas.

3. Fijador de Bouin: Este es un buen fijador para uso general con tejido animal y vegetal. Es difícil de eliminar de los tejidos que se quieren teñir. Su mayor ventaja es que los espécimenes pueden ser almacenados en el por largo tiempo. Mezcle 5 ml. de ácido acético puro y 25 ml. de aldehído fórmico al 40% con 75 ml. de ácido pícrico acuoso saturado. Deje el tejido en el fijador de 24 a 48 horas; luego lave en alcohol de 70% hasta que el color haya sido removido.

4. Fluido de Allen: Este es un fijador de uso general. Se colocan pedazos pequeños de fijador en él por 24 horas, luego se lavan en alcohol de 70% hasta que no ocurra más cambio de color. Luego se transfiere el tejido a alcohol fresco de 70% hasta que vaya a ser usado.

El fluido de Allen se prepara combinando:

Acido crómico	1 gramo
Acido pícrico	1 gramo
Urea	1 gramo
Acido acético puro	10 ml.
Formalina (aldehído fórmico al 40%)	15 ml.
Agua	75 ml.

5. Solución de Carl: La solución de Carl es un excelente preservativo para formas de insectos. Se deberá añadir una pequeña cantidad de glicerina a la solución si se quieren preservar insectos de cuerpo duro. Esto evitará que se vuelvan quebradizos en el preservativo. La solución se prepara combinando primero:

Alcohol etílico (95%)170 ml.
Formalina (aldehído fórmico al 40%)	60 ml.
Agua	280 ml.

Luego, justo antes de usar se deberán añadir 20 ml. de ácido acético puro a la solución.

6. F.A.A. (Aldehído fórmico, alcohol, ácido acético): Este es un buen preservativo para plantas y animales. Endurece los tejidos de las plantas. Los tejidos pueden almacenarse en esta solución durante años. El tejido de una hoja deberá ser matado y endurecido en esta solución por 24 horas, varillas leñosas deberán permanecer ahí por una semana. Muchos animales pequeños pueden ser fijados en este fluido. No es necesario lavar los tejidos una vez que han sido preservados en F.A.A. Para preparar F.A.A., combine los siguientes materiales:

Alcohol etílico (95%)	50 ml.
Aldehído fórmico (40%)	10 ml.
Acido acético puro	2 ml.
Agua destilada	40 ml.

7. Preservativo para plantas verdes: Esta solución evita la decoloración de la clorofila en el tejido de la planta. Añada suficiente sulfato de cobre a F.A.A. (arriba mencionado) como para preparar una solución saturada. Es posible almacenar especímenes en este preservativo indefinidamente, aunque se recomienda transferir los especímenes a una solución fresca cada año.

8. Fijador de Zenker: Este es un fijador muy usado en el trabajo histológico, pero se deberá tener mucho cuidado porque es muy venenoso (si se inhala). Los instrumentos de acero se corroerán en él y se echarán a perder sus propiedades fijadoras. No es muy estable. Sólo se deberán preparar pequeñas cantidades a la vez. Mezcle con mucho cuidado lo siguiente:

Dicromato de potasio	2,5 gramos
Agua	100 ml.
Cloruro de mercurio	15 gramos
Sulfato de sodio	1 gramo
Acido acético puro	5 ml.

Se deberá lavar el tejido en alcohol de 70% por 24 horas luego de que el tejido haya sido remojado en fijador por 24 horas.

9. Fijador de Flemming: Un buen fijador para estudio histológico cuidadoso. Se deberán mantener los tejidos en él durante por lo menos 24 horas, luego se deberán lavar en alcohol de 70% por 24 horas. Para preparar, mezcle:

Acido ósmico (1%)	10 ml.
Acido crómico (10%)	3 ml.
Agua	19 ml.
Acido acético puro	2 ml.

10. Fluido de Gafe: Este fijador se usa principalmente para tejidos de plantas; se recomienda para mostrar los cromosomas en las puntas de raíces. Se remojan los espécimenes por 24 horas en esta solución, luego se lavan en agua corriente por 2 horas. Combine:

Acido crómico	0,7 gramos
Acido acético puro	0,5 ml.
Agua	100 ml.

11. Fijador de Kleinenberg: Se recomienda este fijador para embriones de pollo y pequeños organismos marinos. Se deberá fijar el tejido por 10 horas, y luego se deberá lavar en alcohol de 70% por una hora. Se prepara añadiendo ácido pícrico a una solución acuosa de ácido sulfúrico al 2% hasta que se alcanza el punto de saturación.

12. Formalina: Esta solución base concentrada es una solución de gas de aldehído fórmico al 40% en agua. Cuando se usa formalina como fijador, se diluye una parte de solución base concentrada en diez partes de agua. Esta es una solución de formalina al 10%.

Otras soluciones

1. Albúmina de Mayer: Se usa como goma para sostener secciones de tejido o protozoos al portaobjeto para que no se desprenden durante el proceso de deshidratación-teñido. La solución base concentrada se prepara con:

Albúmina de huevo	50 ml.
Glicerina 1 cristal de timol (ó 1 gramo de salicilato de sodio)	50 ml.

Agite vigorosamente la mezcla de estas substancias químicas de manera que las burbujas de aire queden atrapadas en la solución. Cuando asciendan a la superficie, elimine la masa en forma de espuma y mantenga el líquido limpio. Se mantendrá de 2 a 4 meses sin malograrse. Cuando se vaya a usar la solución, añada 3 gotas de ésta a 60 ml. de agua destilada. Con un dedo limpio esparza una película muy fina sobre un portaobjeto limpio antes de añadir las soluciones.

2. Bálsamo (Bálsamo de Canadá): Se usa para unir cubreobjetos a los portaobjetos de manera permanente para proteger los especímenes. Viene ligeramente acidógeno y deberá ser neutralizado con carbonato de sodio cuando se trabaje con soluciones colorantes básicas.

3. Celulosa de metileno (para disminuir la velocidad de los protozoos): Se prepara esta solución disolviendo 10 gramos de celulosa de metileno en 90 ml. de agua. Coloque un pequeño anillo de ésta sobre un portaobjeto y llene el circulo con un cultivo de protozoos. A medida que la celulosa de metileno se esparce hacia el centro, los protozoos disminuirán su velocidad.

4. Solución de gelatina: Una solución de gelatina del 2% al 3% también puede ser usada para disminuir la velocidad de protozoos. Se prepara disolviendo gelatina en agua fría y luego calentando ligeramente para asegurarse de que se esté disolviendo. Se añade una gota fría a una gota de cultivo en el portaobjeto.

5. Oxalato de sodio u oxalato de potasio: Cualquiera de estas dos substancias químicas puede ser usada para evitar que la sangre de mamíferos se coagule. Esto se logra añadiendo 0,1 gramos de cualquiera de estas substancias por cada 100 ml. de sangre.

6. Anticoagulante para sangre: Añada 200 mg. (0,2 gramos) de citrato de sodio a 10 ml. de sangre.

Técnica para preservar partes de plantas en tela plástica

Este es un buen método para preservar flores y hojas de plantas. Colocando las partes de las plantas en tela plástica, éstas pueden ser exhibidas y examinadas con facilidad. También pueden ser examinadas con un lente de mano o bajo el objetivo de menos fuerza del microscopio.

1. Recolecte flores con algunas hojas y colóquelas en aceite de ricino por veinticuatro horas.

2. Presione las flores y hojas entre hojas de papel periódico o papel secante en una prensa para plantas durante veinticuatro horas. Si no se cuenta con una prensa para plantas, coloque las flores entre muchas hojas de papel, coloque una tabla en la parte superior, y coloque unas cuantas piedras grandes sobre la tabla.

3. Lave las flores en xilol por tres horas para eliminar el aceite de ricino y para suavisar las plantas. Disponga las flores de la manera que Ud. quiera que estén en su tela plástica. Presione las plantas en una prensa para plantas por otras 24 horas para secarlas.

4. Pinte las partes de la planta con barniz transparente.

5. Disponga las flores en una hoja plástica; deje un espacio de por lo menos una pulgada alrededor de la flor. Cubra la tela plástica y plánchela con una plancha fría para sellar. Las plantas se encuentran ahora protegidas de la corrupción y durarán por varios años manteniendo sus colores naturales.

Para preparar esqueletos de plantas

Se sumergen las hojas en una solución en ebullición lenta por dos minutos. Esta solución se prepara hinviendo juntos:

Una vez que la solución se haya enfriado y haya sido filtrada estará lista para ser usada. Hierva las hojas hasta que se tornen color marrón oscuro. Luego coloque las hojas en una fuente poco profunda y frótelas con una escobilla suave para eliminar el tejido. Si los tejidos no se separan de las venas, vuélvalas a hervir. Descolore los esqueletos en una solución preparada con un litro de agua y una cucharada de cloruro de calcio. Seque los esqueletos y móntelos. Pueden ser montados en placas para proyector de diapositivas como proyectos.

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